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黄曲霉毒素一般检测方法概述

发布日期: 2017-05-31
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【薄层色谱法】

1.薄层层析(TLC)法

TLC 法是测定黄曲霉毒素的经典方法,在薄层板展开后,在365 nm紫外灯下,黄曲霉毒素B1B2G1G2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。TLC 法的特异性较差,灵敏度相对较差,且测定黄曲霉毒素专一性不够,经常引起测量误差。但由于此法设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用。

 

2.薄层(HPTLC)法

HPTLC 法测定黄曲霉毒素采用目前国际上流行的样品处理方法——固相萃取法(SPE)中针对真菌和病毒的多功能净化(MFC)柱。采用MFC柱净化后,仅用单相展开即可达到分离测定的目的,不仅节省了工作时间,提高了工作效率,而且进一步减少了有毒有害溶剂的用量。Stroka等将免疫亲合柱净化应用于 TLC法测定,进行单相展开并用荧光密度计定量,此方法能检测含量明显低于当前欧盟标准的黄曲霉毒素。Kamimura 等用HPTLC方法测定玉米、花生、荞麦等样品,并与通过公职分析化学家协会(AOAC)认证的分析花生及花生制品中黄曲霉素的方法CBContamination Branch)法和 BFBest Foods)法进行比较,4种主要黄曲霉毒素的检测限均不高于0.2μgkg,回收率与CB法一样均高于BF法。

 

3.高压薄层色谱(OPTLC)法

高压薄层色谱于1979年由Tyihak提出,它结合了经典薄层色谱法、薄层色谱法与液相色谱法的优点,是一种能够提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。随着实验技术的不断成熟,OPTLC 法在饲料和食物中黄曲霉毒素的检测方面的应用越来越多。Eszter Papp等发展了一系列适合检测玉米和小麦中黄曲霉毒素的OPTLC方法。

 

【液相色谱(HPLC)法】

由于具有稳定、准确、灵敏等优点,HPLC法已成为当前进行黄曲霉毒素定量研究的方法。分析黄曲霉毒素的液相色谱方法包括正相液相色谱方法(NPLC)和反相液相色谱方法(RPLC)。反相液相色谱(RP-HPLC)系统易操作,流动相具有低毒性,可同时分离、分析样品中黄曲霉毒素B1B2G1G2且不受样品沸点、热稳定性、和分子量限制,所以目前使用荧光检测器的反相HPLC法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法。

Chiavaro等根据不同环式糊精增强黄曲霉毒素B1B2G1G2M1荧光释放的不同效果,发展了将环式糊精加入到流动相中的液相色谱法,黄曲霉毒素 B1B2G1G2 的检测限均在0.3μgkg以下,M1的检测限在0.0005μgkg以下,几种黄曲霉毒素都呈线性反应关系。这种方法也被用于测定自然污染及人工添加样品。

 

【免疫学方法】

黄曲霉毒素的免疫学检测方法是将生物大分子的免疫学特性与化学特性结合起来的检测方法。该方法具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高的特点,特别适合于大批量样本的检测。用于检测黄曲霉毒素的免疫学方法有酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、亲和层析法、荧光偏振免疫测定法及免疫层析法。

 

1.酶联免疫吸附测定(ELISA)

ELISA法是在免疫学和细胞工程学基础上发展出来的一种微量检测技术,分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法,其优点是对黄曲霉毒素B1的检测定性定量准确而且检测速度快(比薄层法提高了近 200倍),特异性强,荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰,回收率高,提取方法简单,成本较低,特别适合于对黄曲霉毒素Bl污染监测控制中大量样品的筛查。缺点是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响,测定结果重复性较差,测定结果易出现假阳性问题;此外ELISA试剂寿命短,需要低温保存,葡萄酒类、含盐量高的酱油、含脂量高的花生油在提取时要进行调节pH 值、脱盐、脱脂等特殊处理。

 

2.亲和层析法

亲和层析法利用免疫化学反应原理,采用大剂量的单克隆抗体,选择性吸附提取液中的抗原物质黄曲霉毒素。由于抗原-抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点,从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度,同时可显著减少有毒有害试剂的使用,有利于操作人员的身体健康和环境保护。

 

3.放射免疫(RIA)

RIA法与ELISA法基本相似,不同的是它们所使用的标记物不同,ELISA 法的标记物为酶,RIA法所用的标记物一般为放射性元素氚(3H)。该方法是将毒素 -3H标记物与样品加抗体进行竞争性结合,除去未结合的部分,测定其放射性,放射性强则说明样品中毒素含量低,反之毒素含量高。实验证明 ELISARIA灵敏度更高且更简便,并且RIA需要特殊设备,有放射性元素污染问题,人员需要安全防护,现在已经很少使用。

 

4.荧光偏振免疫测定法

荧光偏振免疫测定法的主要原理是荧光标记的毒素在样品缓冲液中与未荧光标记的毒素对特异性抗体的竞争性结合。分子质量越大,分子旋转速度越慢,荧光偏振值越大。Nasir等报道了用基于荧光偏振的装置检测不同谷物中的黄曲霉毒素。

 

5.免疫层析(IC)法

IC法是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫分析技术,其操作简单,快速,人员不用培训,且不需特殊的仪器设备,非常适用于现场测试和进行大量样品的初筛。

免疫学与仪器结合方法

 

 

 

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